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蛋白共提取試劑盒對于體外培養細胞的方法

發布日期: 2018-05-21
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    蛋白共提取試劑盒是從培養細胞和動物組織樣品同時抽提RNA和DNAzui為快速簡單的方法。本試劑盒基于硅膠柱純化技術,提取過程中無需使用有毒的酚氯仿抽提,也無需進行耗時的醇類沉淀,整個過程只需35分鐘。該方法得到的RNA可直接用于RT-PCR, Northern blot, poly-A 純化,核酸保護和體外翻譯等實驗。
    1.根據用量取適當的漿蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入PMSF,使PMSF的zui終濃度為1mM。PMSF需現用現加,若目標蛋白含有豐富的半胱氨酸,可以在兩種蛋白抽提液中加入DTT至終濃度0.5mM。
    2.對于貼壁細胞,去除培養液,用PBS洗一遍,用細胞刮刀收集細胞,或用EDTA消化后吹打下細胞(不用胰酶硝化,以免胰酶消化目的蛋白)。500g離心2~3分鐘收集細胞,吸盡上清留下沉淀備用。
    3.對于懸浮細胞:用PBS洗一遍,500g離心2~3分鐘收集細胞,吸盡上清,留下細胞沉淀備用。
    4.每20ul細胞沉淀加入200ul漿蛋白抽提試劑(2×106個細胞沉淀約20ul或40mg)。
    5.用移液器吹打或高速渦旋15秒(可適當延長),必須使細胞沉淀*分散開成單細胞懸液。細胞沉淀分散不*會導致蛋白產量降低。
    6.冰浴10分鐘。
    7.zui高轉速劇烈渦旋10秒,4℃12000~16000g離心10分鐘。
    8.上清即為抽提得到的細胞漿蛋白,立即吸取上清至預冷的樣品管中備用,進行后續的PAGE、Western等實驗,但蛋白濃度較低,可根據需要進行相應濃縮。
    9.沉淀即為細胞核,要*吸盡殘余的上清(避免細胞漿蛋白的污染),加入50-100ul核蛋白抽提試劑。
    10.用移液器吹打或高速渦旋15秒(可適當延長)至沉淀*分散,冰浴10分鐘。
    11.zui高轉速劇烈渦旋10秒,4℃12000~16000g離心10分鐘。
    12.立即吸取上清至預冷的樣品管中,此即為抽提得到的細胞核蛋白。可進行后續實驗或-70℃凍存。 
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